锐赛生物

细胞免疫荧光检测

immunofluorescence

实验原理

细胞免疫化学与免疫组织化学实验都是依据抗原抗体反应和化学显色的原理亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，采用标记的特异性抗体对组织或细胞内抗原的分布进行原位检测技术亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。细胞免疫化学将培养处理后的细胞爬片、固定亚博体彩网站-√、破膜亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、封闭后，加入一抗与抗原蛋白结合，再加入标记有荧光素的二抗与一抗进行反应亚博体彩网站-√，最后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光拍摄来显示细胞中靶蛋白的表达变化和定位。

激光共聚焦扫描显微镜（Confoccal Laser Scanning Microscope, CLSM）是现在最先进的细胞生物医学分析仪器之一，采用激光作扫描光源亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，逐点亚博体彩网站-√、逐行亚博体彩网站-√、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，也是瞬间成像的物点亚博体彩网站-√。从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上亚博体彩网站-√，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦。由于激光束的波长较短亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力亚博体彩网站-√，大约是普通光学显微镜3倍亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。系统经一次调焦亚博体彩网站-√，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像亚博体彩网站-√，这些图像信息都储于计算机内亚博体彩网站-√，通过计算机分析和模拟亚博体彩网站-√，就能显示细胞样品的立体结构。

技术应用

检测靶蛋白如内分泌激素亚博体彩网站-√、蛋白质亚博体彩网站-√、多肽亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、核酸亚博体彩网站-√、神经递质亚博体彩网站-√、受体亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、细胞因子亚博体彩网站-√、细胞表面抗原亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、肿瘤标志物亚博体彩网站-√。

实验流程

实验结果展示

图1 细胞目的蛋白的confocal拍摄照片
A：细胞白光照片;B：标记红色荧光的目的蛋白；C：标记绿色荧光的目的蛋白；
D：DAPI进行核染；E：A-D图片的重叠图片亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

TROUBLESHOOTING

常见问题FQA

Q：哪些荧光染料常用于细胞免疫荧光检测？

Q：怎样选择二抗标记的荧光？

A :二抗标记的荧光颜色的选择非常重要亚博体彩网站-√，要求在实验前根据现有材料和仪器的局限性设计好实验方案亚博体彩网站-√，一般我们进行三种颜色的标记工作亚博体彩网站-√。目前细胞核染料常用PI（红色）或DAPI（蓝色），如果细胞中还表达EGFP（绿色）亚博体彩网站-√，则需要选用其他颜色的荧光素来标记目的蛋白亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，不得已的情况下采用颜色相近亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，后期也要用光谱拆分技术对图片进行处理（需专业人员进行亚博体彩网站-√，不建议采用相近颜色）亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

Q：怎样选择细胞免疫化学爬片所用的固定剂？

Q：做细胞免疫荧光大概提供多少抗体合适亚博体彩网站-√？

A：细胞免疫荧光实验我们需先进行预实验采用普通荧光显微镜进行观察亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。确认实验条件后再进行Confocal拍摄的正式实验。24孔板的细胞爬片在进行一抗37℃孵育时亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，一般加入200ul经BSA稀释的一抗，其稀释倍数需参考抗体说明书亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，如稀释倍数为1：100则每张爬片需要2ul（进行细胞免疫荧光的一抗稀释倍数要比WB的?亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。?亚博体彩网站-√。注意提供的抗体量需满足预实验和正式实验所需的量亚博体彩网站-√。

Q：激光共聚胶显微镜拍摄除用于细胞免疫荧光拍摄外还可以进行哪些检测亚博体彩网站-√？

A：由于各种荧光标记探针的应用，通过对荧光探针分布和荧光强度的分析亚博体彩网站-√，Confocal实验还可以用于进行细胞内游离钙、线粒体膜电位、活性氧、细胞膜流动性亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、细胞结构等实验结果的拍摄和分析工作亚博体彩网站-√。根据客户对细胞处理的要求并且购买合适的探针试剂盒，我们也可以为您进行您实验所需的Confocal拍摄工作。

参考文献

1. Davia LS,R obert DG.Metho ds in Microscopy:Protocols And Concepts from Cells, a Laboratory Manual [M].CSHLPress,2006.

2. Douglas JT, Brooke TM. Cell imaging techniques: methods and protocols[M].Springer,2006.