锐赛生物

靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸亚博体彩网站-√、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往期精品SCI漂亮SCI案例库科研转化成果u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台公司新闻价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉业务招商诚觅英才内部推荐加入我们留言板联系我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料促销活动

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联系电话:

021-80158420

流式周期检测

Flow cycle detection



实验原理


细胞周期(Cell Cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞亚博体彩网站-√。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期:即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期,停止细胞分裂亚博体彩网站-√,执行一定生物学功能(G0期)。

流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的原理:由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间亚博体彩网站-√。PI可以与DNA结合亚博体彩网站-√,其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期,S 期和G2/M 期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率(如图7.7所示)


图7.7流式周期检测图说明


技术应用


检测异倍体的肿瘤细胞,检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响亚博体彩网站-√。


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

细胞株(冻存株或培养细胞)及所需药品

细胞培养信息和药物处理方式

3周

我们提供

剩余药品

基本实验步骤亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、细胞培养照片、流式细胞仪的检测结果图亚博体彩网站-√、分析后的数据和统计结果


实验结果展示



G0/G1

S

G2/M

0h

58.06

40.30

1.64

24h

50.14

36.21

13.65

36h

40.20

29.57

30.23

48h

54.33

27.05

18.62


图1 流式细胞周期检测图


TROUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

TdR法双阻断后细胞未被有效阻断至G0/G1和S期亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

待测细胞周期超过30小时

该同步方法不适合细胞周期过长的细胞亚博体彩网站-√,需改用其他阻断方法。

收样时细胞量过少?

药物作用过强

降低药物浓度亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,减少处理时间,降低对细胞的凋亡作用亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

周期实验数据结果异常那个亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

细胞接种密度过大

造成生长异常

适当降低细胞接种密度亚博体彩网站-√。













常见问题FAQ


Q :流式上机检测细胞周期所需要的细胞量大概是多少亚博体彩网站-√?

A :周期检测一般采用6孔板进行实验,每孔细胞量10的6次方左右。如果进行周期预实验,则检测所需要的时间点较多,一般每隔12小时,需要取6个时间点,每个时间点都需要留细胞样待测亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。需要的细胞量较大,务必通过细胞扩增得到所需实验的细胞量亚博体彩网站-√。


Q :周期检测前对细胞同步化处理的目的和方法是?

A :由于群体中各个细胞处于不同的细胞周期时相之,为了研究某一时相细胞的增殖、凋亡或基因表,需要使细胞处于细胞周期的同一时相,这就是细胞同步化技术亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。同步化通常有两种方式,血清饥饿法和药物阻断法亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。采用血清饥饿法可得到GO期细,可采用0.5%-1%小牛血清的培养基培养细胞48-72 h亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。采用药物阻断法效率高,是目前最主要的细胞同步化方法。对于倍增时间低于30h的细胞,可采用胸腺嘧啶核苷(TdR )双阻断法同步化,即连续2次处理靶细胞各24h,可以将99%细胞阻滞在GO/G1和S期。


Q :流式细胞仪PI染色法检测细胞周期前,细胞需做哪些处理?

A :细胞内的DNA和RNA都可以和PI结合,实验前需用RNase将RNA消化后进行检测;由于PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备,必须先用终浓度70%乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合亚博体彩网站-√。


Q :除流式细胞仪PI染色法外,周期检测还有哪些常见的方法?

A :细胞周期的流式细胞仪PI染色法可精确定量周期不同阶段的细胞比例,且方法操作简便亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。其他可以检测周期的方法还有1) Brdu (5-尿啶脱氧核苷)渗入法: BrdU是胸苷的一种类似物,加入培养基后亚博体彩网站-√,可做为细胞DNA复制的原料,采用荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,可定量研究进入S期的细胞比例。2)应用单克隆抗体识别细胞周期蛋白并结合DNA含量分析细胞周期:如在G1期早期cyclin D1表达处于峰值, cyclin E峰值出现在G1/S, cyclin A对应G2M, cyclin B1则可标示G2/M晚期亚博体彩网站-√。此方法要注意周期蛋白与各细胞周期的对应关系在不同种类的纳胞中并非都遵循。


参考文献

1. David Morgan.The Cell Cycle: Prnciples of Contrl [M]. New Science Pres 2006.

2. Teres S. Hawley.Robert G. Hawley Flow Cytometry Protocol[M] Humana Press.2004.

 
 
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