锐赛生物

靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往期精品SCI漂亮SCI案例库科研转化成果u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台公司新闻价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉业务招商诚觅英才内部推荐加入我们留言板联系我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料促销活动

临床医学创新亚博体彩网站-√,转化造秆遣┨宀释?√;颊?/span>

动物实验亚博体彩网站-√、载体构建亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、细胞实验亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、病理学检测亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、免疫沉淀亚博体彩网站-√、核酸蛋白分析

联系电话:

021-80158420

慢病毒包装

Lentivirus translation



实验原理


慢病毒属于逆转录病毒科亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,名称源自该种病毒长达数年的潜伏期,其中最为人所知的是人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1直径约120nm亚博体彩网站-√,含两条正链RNA亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,可有效的进入细胞核中,对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率亚博体彩网站-√。对以HIV-1为基础进行的慢病毒载体的改造亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,主要是去除致病基因减少辅助质粒与载体质粒的同源性亚博体彩网站-√,最终体现在滴度亚博体彩网站-√、生物安全性和外源基因表达效率上的提高亚博体彩网站-√,见结构示意图亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。
慢病毒包装系统特点:可通过顺式作用元件将携带的基因运送到细胞核亚博体彩网站-√,将要表达的基因序列整合到细胞基因组中亚博体彩网站-√,后续可以通过筛选稳转株获得持续稳定的高表达亚博体彩网站-√。


3.6慢病毒结构示意图(转载自www.labome.com)


技术应用


体外实验多用于感染各种难题转染细胞亚博体彩网站-√,建立稳定表达或沉默目的蛋白的细胞株亚博体彩网站-√。

体外实验可用于基因治疗亚博体彩网站-√、动物模型的制备等亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。


实验流程



病毒提供规格


慢病毒种类

客户提供

病毒规格

提供量

赠送阴性对照

实验周期

过表达慢病毒

过表达基因NCBI登陆号及含该基因的质粒载体亚博体彩网站-√、测序报告

低滴度10^5-10^6 TU/ml

10ml

2ml

2

高滴度10^7-10^8 TU/ml

1ml

0.2ml

3

干扰慢病毒

待干扰基因的NCBI登陆号及靶点序列信息

低滴度10^5-10^6 TU/ml

10ml

2ml

2周

高滴度1-3*10^8TU/ml

1ml

0.2ml

3周



载体图谱


QQ图片6.png

3.8慢病毒辅助质粒载体图谱


实验结果展示


QQ图片.png图3.9RNAi慢病毒感染骨肉瘤细胞图片及qPCR检测干扰效果


3.10慢病毒感染各种细胞图片展示


TROUBLESHOOTLNG

实验问题

原因

推荐解决方法

病毒包装效率过低亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

包装细胞状态不佳

采用状态良好代数较早的293T细胞亚博体彩网站-√,保证包装及辅助质粒的纯度亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,优化慢病毒载体及辅助质粒的转染条件亚博体彩网站-√。

目的基因片段过长

适当扩大包装皿数亚博体彩网站-√。

带有EGFP荧光标记的慢病毒感染细胞后无荧光亚博体彩网站-√?

表达框不正确

确认外源基因与EGFP的表达框无误亚博体彩网站-√,若有问题则需重新构建亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

感染条件不佳

确认细胞状态良好,适当增加MOl值亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,摸索polybrene是否可以增加感染效率亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

GFP阴性对照慢病毒感染细胞后荧光很弱?

细胞状态不佳

确认细胞状态良好亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

感染条件不佳

适当增加MOl值亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,确认添加polybrene是否可以增加感染效率。

靶基因慢病毒感染细胞后状态变差亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

病毒加入量远远超过细胞MOl

重新摸索最佳MOl值亚博体彩网站-√。若细胞本身对于慢病毒过于敏感建议更换病毒类型亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

携带的靶基因表达对细胞状态有影响

漏加酶结合物或者错误的使用终止液

提前终止了反应亚博体彩网站-√。




常见问题 FAQ


Q:根据文献选择慢病毒感染效率应该没问题,为什么要做细胞感染预实验亚博体彩网站-√?

A常见的慢病毒和腺病毒以感染谱广和效果高而著称亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,但是具体到不同细胞,他们对不同病毒类型的感染效率都是不一样的亚博体彩网站-√,甚至于不同实验室的相同名字的细胞对同种病毒的感染效率也是有不同的(因为细胞在不断传代之后,遗传背景已经发生了变化)。在没有判断该细胞的最佳感染病毒类型就贸然选择病毒是存在风险的亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。即使后续的细胞实验是客户自己完成亚博体彩网站-√,我们也需提醒客户规避可能的风险亚博体彩网站-√。


Q:什么是MOl值?如何进行MOl值摸索亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

AMOl(Muitiplicity Of Infection,感染复数)是指病毒感染细胞的比例。选择合适的MOl值,病毒的感染效率以及目的蛋白的表达量越高亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,相对细胞的毒性越小。对于分裂活跃的细胞,比如293细胞亚博体彩网站-√,MOl=1时亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,95%以上的细胞均可以表达目的基因。而对于非分裂细胞亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,比如原代细胞亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,感染效率较低,MOl值可能达到200-300.我们建议通过比较不同MOl(比如0亚博体彩网站-√、1、5亚博体彩网站-√、10、50亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、100等)感染细胞的结果(注意摸索是否需要填加polybrene),现在适合的MOl进行实验:可以先将培养好的细胞接种至96孔板亚博体彩网站-√,然后用携带报告基因EGFP的阴性对照慢病毒亚博体彩网站-√,按照不同MOl值比例感染细胞亚博体彩网站-√,进行MOl值摸索。


Q:慢病毒使用的安全性如何?

A慢病毒已经被全世界许多实验室应用亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,至今没有生物安全性出现问题的报道亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,但仍具有潜在的产生复制型慢病毒和致癌的风险亚博体彩网站-√,操作者在实验中仍需要保持高度警惕亚博体彩网站-√!所有操作均应尽量在生物安全2级实验室的安全柜中进行亚博体彩网站-√,并佩戴一次性口罩和手套亚博体彩网站-√,尤其要避免病毒接触口亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、眼亚博体彩网站-√、鼻亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、耳亚博体彩网站-√、伤口等身体开放性区域亚博体彩网站-√,避免产生气溶胶。显微镜台亚博体彩网站-√、生物安全柜台面等使用后,用75%乙醇擦拭亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。意外洒落的含病毒的液体亚博体彩网站-√,用卫生纸吸干后亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h亚博体彩网站-√。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。


Q:在慢性毒介导的稳转株构建实验中亚博体彩网站-√,慢病毒感染细胞后,整合入基因组中的位点有多少亚博体彩网站-√?

A :慢病毒的整合和加入的病毒量有关亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,加入量很多如MOI值达到100时可以进行多位点整合亚博体彩网站-√,最多5-10个亚博体彩网站-√,注意表达量的高低和整合位点与其在染色体上的位置有关亚博体彩网站-√。质粒很可能是整合在转录活性不强的区域,而慢病毒的偏好性在于转录活性非常强的区域。


Q:对于片段特别大的外源基因,载体构建和病毒包装是否存在困难亚博体彩网站-√?

A基因超过2500bp亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,如果还要增加1300bp大小的IRES-GFP亚博体彩网站-√,则大小将超过3500bp亚博体彩网站-√。因此如果基因太大亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,可以考虑不要加IRES-GFP序亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?亚博体彩网站-√;蚬ざ杂诼远驹靥宓墓菇ɑ嵩斐梢欢ǖ睦蜒遣┨宀释?√,如扩增产生点突变的几率增加亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,扩增酶切回收效率不高亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√;另外基因越大亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,病毒包装效率过低可能导致病毒包装失败亚博体彩网站-√。


Q:订购到的慢病毒如何保存和使用?

A 包装好的慢病毒液全程采用干冰运输亚博体彩网站-√,快递至客户处亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。请务必注意查收亚博体彩网站-√,收到后请打开包装检查干冰是否还有剩余亚博体彩网站-√,病毒种类和规格是否发货单完全一致亚博体彩网站-√。请将慢病毒液在-80摄氏度保持,避免反复冻融亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,6个月内滴度不会明显下降亚博体彩网站-√,建议尽快使用完毕亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。对于保持6-12个月以上的样品,实验前需重新测定滴度亚博体彩网站-√。使用前从-80摄氏度冰箱取出病毒亚博体彩网站-√,置冰上融解亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,待用亚博体彩网站-√。一次用不完的病毒液可以放在4摄氏度冰箱 中亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,一周内使用完毕亚博体彩网站-√。


Q:腺病毒和慢病毒的区别各有哪些?

区分项目

腺病毒

慢病毒

病毒基因组

双链DNA

两条正链RNA

是否整合宿主基因组

表达时长

瞬时表达外源基因

长时间表达,筛选后可稳定表达

是否可以扩增

可以

不可以

最高滴度

可达到10^12IU/ml

可达到10^9TU/ml

细胞感染类型

心肌细胞,神经元细胞亚博体彩网站-√,肿瘤细胞,原代细胞等

干细胞,原代细胞肿瘤细胞等



Q:可以对miRNA的成熟序列进行慢病毒包装工作吗亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

A可以亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,请提供miRNA的成熟序列的序列信息即可。我们将进行miRNA过表达慢病毒载体的构建亚博体彩网站-√、包装、滴度检测及miRNA的qPCR检测亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,详情请见第七章技术服务内容亚博体彩网站-√。



参考文献

1.Buchschacher GL Jr, Wong-Staal F.Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseasea. Blood2000,95(8):2499-2504.

2.Pandya S, Klimatcheva E, Planelles V. Lentivirus and foamy virus vectors: novel gene therapy tools Expert Opinionon Biological Therapy 2001,1(1):17-40.

3.Park F, Kay MA.Modifred HIV1 based lentiviral vectors have an effect on viral transduction efficiency and geneexpression in vitro and in vivo. Mol Ther 2001,4(3):164-173.

 
 
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