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目的基因ORF克隆

ORF cloning

实验原理

ORF 克隆是指从样本组织或细胞中抽提总 RNA亚博体彩网站-√，反转录，设计合成特异性引物后，通过 RT-PCR 扩增获得目的基因的 DNA 序列亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，获得编码全长蛋白质序列的 DNA 序列：即从起始密码 ATG 到终止密码子，不含 5′或 3′UTRs 非翻译区）及内含子序列亚博体彩网站-√。

技术应用

目的基因的表达研究

基因亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、蛋白的功能研究

实验流程

实验结果展示

                  A                                                       B                                                              C

图1 目的基因的ORF克隆实验结果

A:样本1和样本2的RNA抽提电泳结果 亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√；B 不同扩增条件下目的片段的PCR扩增结果亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√；C 目的片段酶切鉴定结果（T载体片段2692bp亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，目的片段1100bp）亚博体彩网站-√。

TROUBLESHOOTLNS

常见问题FAQ

Q：我怎样获得含有母的基因序列的质粒呢亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√？

A :明确目的基因的种属和基因的 NCBI 登录号后，如果想通过调取的方式获得则需要了解该基因在哪些组织或细胞中表达丰度较高亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，即通过 ORF 克隆获得蛋白翻译序列亚博体彩网站-√，然后构建至质粒中亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√；若基因表达丰度低亚博体彩网站-√，难于调取可以考虑通过化学合成，即合成长片段引物亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，分段扩增拼接得到全长序列亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，然后构建至质粒中亚博体彩网站-√。

Q : ORF 克隆服务若需客户提供材料需要哪些注意事项亚博体彩网站-√？

A :通常我们可从公司的常见肿瘤细胞和正常组织的 cDNA 库进行调取工作。若客户提供高表达目的基因的特定组织或细胞亚博体彩网站-√，请注意实验材料必须保证新鲜亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，即采样后需立即放入液氮中速冻或研磨加Trizo?亚博体彩网站-√；ひ?，保证RNA 无明显降解，组织样本提供总量大于 50mg亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，细胞样本总量大于 1*10^5亚博体彩网站-√。

Q:收到的质粒和菌株如何保存亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√？

A:收到的质粒和菌株如需长期保存请置于 -80 ℃，菌株活化可以通过平板划线后，挑取单克隆过夜摇菌亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。一般质粒较菌株更加稳定亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，若菌株已无法活化亚博体彩网站-√，可以将质粒转化大肠杆菌亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，重新保存菌株亚博体彩网站-√，并可以抽提更多质粒以进行后续的实验工作亚博体彩网站-√。

Q: cDNA 克隆与 ORF 克隆的区别是什么？

A:cDNA克隆比ORF克隆多了5′或3′UTRs序列。注意5’UTR序列可能会形成复杂二级结构亚博体彩网站-√，影响基因的表达效率，因此一般采用 ORF 克隆进行表达研究亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

Q:调取出来的序列与NCBI上相同基因名称的序列比对时亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√，发现两者间有一定程度上的差异，如何解释？

A:由于编码基因的多选择性剪接亚博体彩网站-√，一个基因通?；嵊卸喔鲎疾铮ㄍǔＪ浅ざ痰牟钜欤┭遣┨宀释?√，因此可通过文献确定最具有代表性的转录本亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√；另外由于调取样本的来源导致的基因遗传多态性，会出现一些有义或无义的突变亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。我们可以通过比较多个克隆的测序结果确认这些突变并非是由于 PCR 引入的亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。如果酶的保真度出现问题亚博体彩网站-√，出现的点突变会是随机发生的亚博体彩网站-√，不可能在每个克隆的同一位点发生相同的突变亚博体彩网站-√。无义突变不会影响蛋白的翻译序列亚博体彩网站-√，一般可以接受。若怀疑有义突变会影响到蛋白功能就需要进行突变修复工作。

参考文献

1. Joseph Sambrook, E. F. Fritsch,Tom Maniatis. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

2. Benjamin Lewin. Genes lx [M]. Pearson Education,2017.