锐赛生物

靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往期精品SCI漂亮SCI案例库科研转化成果u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台公司新闻价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉业务招商诚觅英才内部推荐加入我们留言板联系我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料促销活动

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联系电话:

021-80158420

荧光实时定量PCR

QPCR



实验原理


实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团亚博体彩网站-√,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量亚博体彩网站-√。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种:荧光染料和荧光探针亚博体彩网站-√。


荧光染料SYBR Green:嵌入到双链DNA分子后构象发生变化,能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光亚博体彩网站-√;而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步亚博体彩网站-√,见图 4.1。


4.1.jpg

图 4.1 SYBR Green 荧光染料法qPCR检测原理图


TaqMan 荧光探针:扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。探针完整时亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,见图 4.2。

4.2.jpg

图 4.2 TaqMan 荧光探针法qPCR 检测原理图


SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别


方法

优点

缺点

应用

SYBR GREEN

方便快捷,不必针对各个基因设计合成TaqMan探针亚博体彩网站-√,具有价格优势。

无模板特异性亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,对引物特异性要求较高,需进行熔解曲线分析亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√;灵敏度相对较低。

应用于基因的差异表达分析亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,比RNA干扰效果确认。

TaqMan 探针法

荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上,具有高度特异性,重复性好亚博体彩网站-√,荧光信号强。

只适合一个特定的目标亚博体彩网站-√,探针价格较高亚博体彩网站-√。

通常应用于基因拷贝数的确定亚博体彩网站-√,在临床诊断中最常用亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,比如病毒和病原菌定量检测亚博体彩网站-√。


技术应用


定量方法

原理

技术应用

绝对定量

(Absolute Quantification亚博体彩网站-√,AQ)

是测定目的基因在样本中的分子数目亚博体彩网站-√,即通常所说的拷贝数亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

病原体检测亚博体彩网站-√;

转基因食品检测亚博体彩网站-√;

基因表达研究亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

相对定量

(Relative Quantification,RQ)

测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例亚博体彩网站-√,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

基因在不同组织中的表达差异;药物疗效考核亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√;耐药性研究亚博体彩网站-√。



实验流程


流程.jpg



实物

数据信息

实验周期

客户提供

样本

靶基因NCBI登录号

4

我们提供

基本实验步骤亚博体彩网站-√、EXCEL原始数据扩增线,溶解曲线


实验结果展示


1)目的基因          

 

目的基因.jpg

                                                   

2)内参基因

内参基因.jpg


3)柱形图

柱形图.jpg

图 4.3  A亚博体彩网站-√、B 两种细胞经加药处理后目的基因在各个时间点的qPCR相对定量表达量检测

1)目的基因的扩增曲线与熔解曲线亚博体彩网站-√;2)内参基因的扩增曲线与熔解曲线 ;

3)目的基因在 A、B 两种细胞加药处理后各个时间点的表达量柱形图(2-ΔΔCt相对定量数据处理)亚博体彩网站-√。


扩增曲线和溶解曲线的常见术语:


基线

Baseline

PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大亚博体彩网站-√,接近一条直线亚博体彩网站-√,即称为基线亚博体彩网站-√。

荧光域值

Threshold Value

一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值3-15个循环荧光信号标准差的10 倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

Ct

Threshold Cycle

扩增产物的荧光信号进入指数增长期时所经历的循环数。模板的Ct与起始拷贝数的对数存在线性关系亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,起始拷贝数越多,Ct 值越小亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

熔解曲线Tm

Tm Of Melting Curve

SYBR Green染料发实验结束后需对qPCR产物加热亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,随着温度的升高亚博体彩网站-√,双链接扩增产物逐渐解链亚博体彩网站-√,导致荧光强度下降亚博体彩网站-√,到达某一温度时亚博体彩网站-√,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降亚博体彩网站-√,将此温度称为Tm值亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。不同PCR产物Tm值不同亚博体彩网站-√,从而可对PCR的特异性进行鉴定亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。


TROUBLESHOOTING


实验问题

原因

推荐解决方法

Ct 值起跳过晚

引物设计不佳

重新设计引物,RT—PCR摸索好扩增条件亚博体彩网站-√。

扩增效率低

降低退火温度亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,适当提高镁离子浓度亚博体彩网站-√;PCR产物长度控制在100bp 左右亚博体彩网站-√;荧光染料未降解。

模版量低

增加反应循环数亚博体彩网站-√,提高模版量。

Ct 值起跳

引物设计不佳

重新设计引物,RT—PCR摸索好扩增条件亚博体彩网站-√。

模板量低

增加反应循环数亚博体彩网站-√,提高模板量亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

熔解曲线出现双峰?

非特异性扩增条带

优化PCR反应条件亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,如提高退火温度亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,降低镁离子浓度;若优化失败需重新设计引物。

引物二聚体

降低引物浓度或重新设计引物。

基因组污染

抽提获得的RNADNase I消化基因组DNA后进行后续实验。


常见问题FAQ


Q:qPCR与普通PCR的区别是什么亚博体彩网站-√?

名称

特点

普通PCR

PCR反应结束后对终点产物进行电泳定量分析亚博体彩网站-√,误差较大亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

qPCR

实时检测PCR扩增过程,在扩增的指数期对起始模板量进行定量分析亚博体彩网站-√,重复性好亚博体彩网站-√,误差小亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。


Q:请问进行相对定量检测前提供组织样本时需要将组织块定量吗亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

A:不需要亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,采用qPCR相对定量法主要是以表达量稳定的内参基因作为对照从而判断目的基因相对表达丰度。我们在实验操作中会对各个环节进行把控亚博体彩网站-√,确保实验结果的客观性:1)组织抽提的RNA会进行定量;2)正式上机前对样本进行RT-PCR检测确定反应条件;3)上机检测后的相对定量数据分析,计算每个样本目的基因对相对稳定的内参基因的表达差异亚博体彩网站-√,可以排除上样量的差别对数据分析的影响亚博体彩网站-√。


Q:可以进行miRNA的荧光定量PCR检测服务吗?与编码基因的qPCR操作流程上有何区别?  

A:可以亚博体彩网站-√,采用专用的miRNA荧光定量PCR试剂盒即可。与编码基因的qPCR检测流程上的主要区别是需要将提取后的RNA亚博体彩网站-√,用poly(A) 聚合酶在其3’末端加尾亚博体彩网站-√,再用5’端带40nt延伸序列的单碱基锚定Oligo-dT引物进行反转录亚博体彩网站-√,得到约80ntcDNA亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,然后用特异引物进行SYBR   Green实时定量PCR扩增。其中miRNA的引物设计需要大量摸索,才能获得重复性高可信度高的数据亚博体彩网站-√。


Q:如何制备绝对定量 PCR 的标准品亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

A:将欲定量基因的一小段序列(200-300bp)克隆到T载体上亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,经测序验证后,进行小量抽提亚博体彩网站-√,采用分光光度计定量,按照公式计算拷贝数后梯度稀释亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,用于上机绘制标准曲线亚博体彩网站-√,从而计算待检测基因的拷贝数多少亚博体彩网站-√。


Q:荧光定量PCR有哪些注意要点亚博体彩网站-√?

A:荧光定量PCR的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。RNA的抽提需要严格进行RNase

free的操作亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,抽提的RNAOD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增亚博体彩网站-√。另外亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定亚博体彩网站-√,退火温度在55-65° C之间。除此之外,其他各个环节如试剂的稳定性亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,RNA反转的质量好坏亚博体彩网站-√,PCR上机条件的设定亚博体彩网站-√,加样的手法和熟练度等等也要注意亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。


Q:荧光定量PCR引物的设计原则是什么亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

A:1)扩增产物长度在80-200bp亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√;引物应在核酸序列保守区内设计并有特异性;引物通常设计为跨内含子亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

2)产物不能形成二级结构;引物长度在18-30bp之间亚博体彩网站-√,其中碱基应随机分布亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√;待扩增的片段Tm值应在55-65°C之间;待扩增的片段GC含量在40-60%之间亚博体彩网站-√;引物自身及引物之间不能有连续4个碱基的互补亚博体彩网站-√。

3)引物5′端可进行修饰,3′端不能进行修饰亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√; 引物3′端要避开密码子的第3位亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。


Q:如何设计荧光定量PCR的TaqMan探针亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

A:TaqMan探针的设计原则为尽量靠近上游引物亚博体彩网站-√;长度一般为30-45bp亚博体彩网站-√,Tm 值至少比扩增引物高 5° C亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√;5′端不能为 G亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,因为 G 会淬灭荧光亚博体彩网站-√,从而影响定量;设计时亚博体彩网站-√,需要通过软件来进行设计亚博体彩网站-√,网络上有许多免费的以及在线的设计软件可以使用亚博体彩网站-√。


Q:可否设计羊源亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√、猪源等其他物种基因的qPCR引物亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√?

A:可以设计,但对于人,大鼠亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,小鼠常规模式生物以外的基因(由于无法在NCBI获得完整的基因序列信息)亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√,在进行PCR优化的时候难度远远大于常规生物基因,周期会增加,且可能需设计多对引物才可能获得满意的实验结果亚博体彩网站-√。


Q:判断扩增曲线是否良好的指标有哪些亚博体彩网站-√?

A:1)曲线拐点清楚亚博体彩网站-√,特别是低浓度样本指数期明显。

2)曲线指数期斜率与扩增率成正比亚博体彩网站-√,斜率越大扩增效率越高亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

3)标准的基线平直或者略微下降,无明显的上扬趋势亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√亚博体彩网站-√。

4)各管的扩增曲线平行性好亚博体彩网站-√,表明各反应管的扩增效率相近亚博体彩网站-√。


参考文献

  1. Livak KJ, Schmittgen TD.  Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001亚博体彩网站-√,25:402–408.

  2. Michael A. Innis,David H. Gelfand,John J. Sninsky. PCR Applications: Protocols for Functional Genomics. Academic.

 
 
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